我国是一个贫硒大国，从我国东北到西南的2/3地区贫硒(1)。肝癌、肝病、克山病、大骨节病又是我国的多发病，流行病学调查证实：急性乙型肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌病人血液硒含量均低于正常人(2)。因此，我们国家对硒和硒蛋白的研究和投入是关系到我国可持续发展战略的重要问题。在自然界硒以无机硒，亚硒酸钠、硒酸钠，有机硒，硒半胱氨酸、硒蛋氨酸形式存在于动物、植物和土壤中。硒是以硒半胱氨酸、硒蛋氨酸掺入蛋白的。在人体和动物体内硒是以活性硒蛋白发挥生理功能的。硒蛋白仅限于含有硒半胱氨酸的蛋白，因为硒蛋氨酸替代蛋氨酸的含硒的蛋白没有生物功能。
硒半胱氨酸掺入硒蛋白是基因阅读框架内UGA指导下完成(3,4)，而UGA在一般正常情况下为终止密码。硒蛋白翻译过程中之所以通过终止密码UGA是因为其mRNA的3'端非编码区有保守的颈环结构，又称硒半胱氨酸插入序列(3,4,5,6)。
至今已有25个硒蛋白分别在动、植物和细菌被发现(7)。而硒蛋白P是唯一的在一条多肽链上有10-12个硒半胱氨酸的奇特的硒蛋白(8)。本文将对硒蛋白P研究历史、特点和现状予以综述。
硒蛋白P的发现历史
早在70 年代，Miller(9) 和Burk(10)首次发现大鼠血浆硒蛋白P，因为该蛋白存在于血浆就以血浆第一字母P命名为硒蛋白P。1977年Herrman(11)试图纯化硒蛋白P，没有成功，但是他发现硒蛋白P结合肝素的特性。Motsenbrocher 和 Tappel(12)用常规纯化方法得到部分纯化的硒蛋白P，并发现蛋白中的硒是以硒半胱氨酸形式存在。多个实验室用常规方法纯化失败后，我国学者杨建国在Burk实验室采用单克隆抗体免疫亲和层析技术首次从大鼠纯化出硒蛋白P(13)。有了硒蛋白P的纯品后，使硒蛋白P的cDNA 从大鼠(14)、人体(15)、牛(16)和小鼠(17)中克隆成为可能。
1、硒蛋白P的纯化
几个实验室经过多次失败后，最后我国学者杨建国在Burk实验室采用单克隆抗体免疫亲和层析技术首次从大鼠纯化出硒蛋白P：用放射性75硒注射大鼠，3小时后取血浆，经离子交换柱层析部分纯化硒蛋白P，再以此蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体，用单克隆抗体交联琼脂糖制成免疫亲和层析柱，经此柱层析一步法纯化出大鼠硒蛋白P，其回收率达50% 以上。以后又以此单克隆抗体建立了定量测定硒蛋白P放射免疫法(13)。最近Takahashi 又用金属镍亲和层析法纯化了人血浆硒蛋白P(18)。
2、硒蛋白P的生化特性
大鼠血浆硒蛋白P在SDS-PAGE 电泳显示分子量57 Kda ,并证实为糖蛋白。用N-聚糖酶消化硒蛋白P可见分子量分别有48 Kda 和43 Kda二条带，而用N-聚糖酶消化则没有改变，说明硒蛋白P为N-糖基化(19)。
测定硒蛋白P中的硒含量为每分子肽链含7.5 个原子。氨基酸分析发现所有的硒以硒半胱氨酸形式存在于蛋白中。用溴化氰处理硒蛋白P可得到分子量20 Kda 和40 Kda二个主要的肽链，而20 Kda的肽链为硒富集区(19)。
3、硒蛋白P分子生物学
用单克隆抗体免疫亲和层析技术纯化的硒蛋白P免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，再用此抗体筛选大鼠肝cDNA文库，得到600 bp 硒蛋白P基因片段，再用此片段为探针筛选λZAP II 大鼠肝cDNA文库获得全长硒蛋白P的cDNA(14)。以后又以大鼠cDNA为探针筛选人肝、心cDNA文库，获得全长人硒蛋白P的cDNA(15)。
在硒蛋白P的cDNA的阅读框架内，大鼠编码385个氨基酸，人体编码381个氨基酸。起始的前19个氨基酸是信号肽，第20个氨基酸为天然硒蛋白P的第一个氨基酸，说明硒蛋白P是一个细胞外蛋白。
大鼠和人的基因和氨基酸序列比较表明：69%的基因序列和72%的氨基酸序列有同源，最少保守的氨基酸是天门冬酰胺，最好保守的氨基酸是蛋氨酸和色氨酸，除去信号肽外大鼠硒蛋白P分子量为41，052；人体为41，229。大鼠和人体的基因中分别有5个和6个N-糖基化位点。
硒蛋白P的基因和氨基酸的序列分析惊人的发现：它是一个奇特的基因。因为其cDNA的阅读框架内含有十个终止密码TGA（通常TGA作为翻译的终止密码），每个TGA编码为硒半胱氨酸，而靠近C端的15个氨基酸内有4个硒半胱氨酸，靠近C端的120个氨基酸内有9个硒半胱氨酸。硒蛋白P的氨基酸的序列分析提示：这些硒半胱氨酸与硒蛋白P的功能有关。
纯化的大鼠硒蛋白P硒含量测定为每分子肽链含7.5 个原子，而其cDNA推测为10个硒半胱氨酸，二者的差异可能是和准备测定样品时蛋白降解有关。当然，另外二种可能性也会发生：因为C端有多个硒半胱氨酸会在任一个TGA处提前终止；或者在翻译后蛋白修饰时被切掉。
硒蛋白P的碱性氨基酸占优势，这决定了它结合肝素的特性。它有二个组氨酸富集区（在氨基酸185-198 和225-234 ）。这些碱性氨基酸使它很容易和细胞膜结合。
真核细胞硒蛋白P的3'端(3' utr) 有二个颈环结构（称为硒半胱氨酸插入序列）是蛋白翻译时通过阅读框架中UGA而插入硒半胱氨酸所必需。比较大鼠和人体硒蛋白P的基因序列有高度保守性，提示此结构的重要性。
Berry 研究了硒蛋白P的3'端(3' utr) 有二个颈环结构在表达I型碘化甲腺氨酸5'脱碘酶（5' DI）中的作用，惊人的发现用硒蛋白P的3'端(3' utr) 有二个颈环结构替代5' DI的颈环结构后，在COS7表达可使5' DI的活性提高3.7倍，提示硒蛋白P基因的硒半胱氨酸插入序列有重要作用。
4、硒蛋白P的生理学
硒蛋白P和谷胱甘肽过氧化物酶是仅知的血浆硒蛋白，硒蛋白P占有血浆中的60%的硒。人体血浆硒蛋白P的含量决定于不同个体的总体硒状态。正常人一般血浆硒蛋白P为50 nM 或3 ug/ml,而实验足硒大鼠血浆硒蛋白P为25-30 ug/ml(19)。在肝和心脏均证明合成和分泌硒蛋白P，后来又用Northern 方法分析证实肾脏、肺脏、睾丸和脑也有硒蛋白P的表达(23)。多组织器官有硒蛋白P的表达提示硒蛋白P的功能的多样性。如果仅是血浆需要硒蛋白P，有肝合成和分泌就足以满足需要。硒蛋白P的碱性区说明它和细胞膜有关，Wilson 和Tappel 证实硒蛋白P与细胞的浆膜有关(24)。
硒蛋白P在硒的体内代谢中起着主要作用是根据它在血浆中的浓度。它占大鼠整体硒含量的8%(19)，它在血浆中的半衰期为4小时(25)。这提示它的合成非常迅速，而谷胱甘肽过氧化物酶较慢。缺硒的大鼠血浆中硒蛋白P含量降低。用不同量的硒饲养大鼠的实验，比较硒蛋白P的含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。当在饲料中补给缺硒的大鼠硒时血浆中硒蛋白P含量首先增加，而后是谷胱甘肽过氧化物酶活性增加。当注射缺硒的大鼠硒时血浆中硒蛋白P含量迅速增加，在2小时内增加到对照组的75%，而血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性仅增加到对照组的6%。实验说明硒蛋白P的合成先于谷胱甘肽过氧化物酶(26)。
Hill 用Northern 方法分析了缺硒的大鼠肝脏硒蛋白P和谷胱甘肽过氧化物酶mRNA的水平。发现缺硒的大鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶mRNA是对照的3%，而硒蛋白P是对照的19%。实验说明硒蛋白的mRNA有不同的调控机制(23)。以后Christensen 和Toyoda 分别证实缺硒并不影响硒蛋白P的转录效率，缺硒的大鼠mRNA的减少和它的降解有关(27)。
Tappel 报导几种组织有硒蛋白P受体存在(28)。Burk 用同位素75硒注射缺硒和对照组大鼠以探讨硒蛋白P受体在不同组织的存在(25)。实验发现只有脑组织在缺硒大鼠摄取硒的速率为对照组大鼠的几倍，而肝、肾和睾丸缺硒大鼠和对照组大鼠没有差异。实验说明只有脑组织支持有硒蛋白P受体存在，但不支持其他组织有硒蛋白P受体存在。硒蛋白P和细胞亲和性强可能与它含有多个碱性氨基酸和细胞膜上带负电的分子结合有关。
硒蛋白P的功能
1、转运硒的作用：
Tappel 提出“硒蛋白P在肝脏合成后分泌到血液以转运蛋白形式运送硒到外周组织”，这是因为同位素75硒注射大鼠后，在外周组织摄入前首先在血浆中出现(28)。另外，他又发现硒蛋白P和细胞膜结合进而提出硒蛋白P受体的存在。为此硒蛋白P具有转运硒的作用。
Burk的动物体内实验表明转运硒的作用不是硒蛋白P的主要功能，因为许多组织都表达硒蛋白P(25)，而Kato 认为血浆中小分子的硒更发挥转运硒的作用(29)。
2、抗氧化作用：
Hafemai 和 Hoekstra证实缺硒大鼠发生的肝坏死和脂质过氧化有关(30)。Burk 用奈醌（Diguat）注射缺硒大鼠诱肝坏死和脂质过氧化，硒可以通过抗脂质过氧化阻止肝坏死。进一步研究证明硒的抗脂质过氧化与硒蛋白P相关(31,39)。
近来，Tatahashi 用纯化的人血浆中硒蛋白P证明它有磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶的活性，直接证实硒蛋白P的抗氧化作用(32)。
3、解毒作用：
因为硒蛋白P富含组氨酸、半胱氨酸和硒半胱氨酸，它们结合重金属Hg、 Ag 和Cd等形成重金属-硒蛋白P复合物，进而排出体外(33,34)。
4、消炎作用：
人人血浆硒蛋白P减低过氧亚硝酸盐的氧化和硝化作用(35)。过氧亚硝酸盐是炎性毒因子的调节剂，因为它可起动单链DNA断裂(36)。血浆硒蛋白P与血管内皮细胞膜结合拮抗过氧亚硝酸盐的毒性(37)。
5、神经细胞保护作用：
研究证明：牛血浆硒蛋白P是培养的神经细胞生存促进因子。在200 pM 牛血浆硒蛋白P对神经细胞有很好的保护作用(38)。
硒蛋白P与疾病
1、与肝脏疾病：
Burk 测定了肝纤维化、肝硬化和肝癌病人血浆硒蛋白P的含量，结果均明显低于正常人。但是，当对上述病人进行肝移植后其血浆硒蛋白P的含量均达到正常人水平。试验提示血浆硒蛋白P是肝脏合成的，也说明硒蛋白P与肝纤维化、肝硬化和肝癌有关(40)。
2、与克山病：
夏弈明教授研究了中国克山病地区血浆硒蛋白P与克山病的关系。发现克山病病人血浆硒蛋白P的含量明显低于正常人，提出血浆硒蛋白P可以作为诊断克山病生化指标之一(41)。
3、与神经系统疾病：
实验证明过氧亚硝酸盐与神经细胞退行性疾病的致病有关(42)，如老年性痴呆、脊髓侧索硬化(43,44)。而硒蛋白P可还原过氧亚硝酸盐以减少其对神经细胞的损害(45)。
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